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端粒:三十年的进展

 

哺乳动物端粒是由串联重复的TTAGGGn DNA序列组成的,该序列与一个六亚基蛋白shelterin复合物相关,该复合物有助于形成套索状结构(t - loop),以保护端粒DNA的染色体末端免受DNA损伤机制的影响。由于滞后链DNA合成的不完整性,氧化性损伤,核酸外切酶处理以及其它一些因素,导致端粒在所有正常分裂的细胞中,不断地缩短。这种缩短最终导致细胞生长停滞,这被认为是人类和其他大型长寿动物肿瘤形成的最初的增生性障碍。充分证据表明,最短端粒的长度是检测衰老开始的关键生物标志物。然而,最常用的端粒长度测量技术大多只能提供平均端粒长度的信息。因此,目前已发表的研究表明,平均端粒长度的微小的差异与各种年龄相关的病理现象之间存在重要关联,对此,我们应该持有一定的怀疑态度,除非采用更先进的测量最短端粒的方法。

 

这篇文章是我们对端粒和端粒酶领域的主要进展历史的个人回顾。对此主题进行综述是因为有越来越多的证据表明,各种遗传疾病是与端粒维持蛋白或端粒酶成分的突变相关的,这些突变影响着日益增多待医病症。

 

端粒的发现对染色体末端的早期理解

 

 

早期细胞遗传学家Thomas Hunt Morgan是第一个提出遗传特征与染色体上遗传物质交换之间存在联系的人。1911年,他假设基因被排列在染色体上,就像“串线上的珠子”,并以特定的顺序,从开始至结束。基于Barbara McClintock的部分发现,Morgan的一名学生Hermann Muller后来认识到线性染色体的“自由端”与X射线诱导的断裂端表现得有所不同,并将线性染色体的末端称为“端粒”。 HaldaneDarlington也是这么认为,“端粒”一词来源于希腊语,意为“末端”(telos)和“部分”(meros)McClintock是细胞遗传学领域的先驱,那时她正在研究异染色质纽,她可以在玉米细胞的染色体末端看到这些异染色质纽。她把这些不同的旋钮称为染色体的“自然末端”,而且通过破坏有丝分裂的环状染色体,她得出结论,这些自然末端或叫做端粒的东西与MullerX射线照射所引发的断裂末端相比,表现极为不相同。

 

McClintock 最著名的是关于转位因子(跳跃基因)以及表观遗传学基本概念的研究工作,而且她还是第一位科学家认识到被诱导(断裂)的染色体末端明显不同于自然末端不过前者可以被改变成为稳定的自由端,就像自然端粒末端一样。这一观察结果表明,在愈合的末端发生了一些永久性的分子变化,这与我们目前关于端粒酶在染色体愈合过程中的作用的观点是一致的。事实上,在她职业生涯的后期,McClintock根据早期关于特定的不能治愈断裂的末端的玉米品种观察所做的推测,支持了一种观点,即在繁殖细胞中一定有一种酶,这种酶通常可以治愈玉米(染色体)断裂的末端。

 

这些早期的细胞遗传学研究,为确定端粒作为具有独特结构和功能的异染色质的观点奠定了基础,然而,确立端粒的分子特征却经历了几十年。

 

早期细胞培养和Hayflick 极限理论

 

1881年,德国生物学家August Weissman推测,死亡的发生是因为磨损的组织不能更新。然而,1921年,法国诺贝尔医学奖得主、外科医生Alexis Carrel提出,在培养中外植的所有细胞都是永生的,而由于不知道如何最好地培养细胞,才导致在其他实验室中发现细胞缺乏连续复制。这一理论被广为接受,直到Leonard HayflickPaul Moorhead推翻了在培养皿中生长的所有细胞都是不会死亡的这一理论。事后看来,Carrel的团队可能用肉瘤病毒感染了细胞培养物,从而使细胞永生,或者使用未经过滤的小鸡胚胎提取物,无意中继续用活细胞重新播种培养物。

 

不管Carrel对连续的细胞培养观察作何解释,Hayflick 引发了对细胞衰老现象的研究,这种现象通常被称为Hayflick极限 (Hayflick limit) 理论。尽管基本的Hayflick极限概念总体上已经受住了时间的考验,但其他人仍持怀疑态度。例如,Harry Rubin认为,人类纤维母细胞复制数量的遗传决定理论是建立在假象上的,这是由于外植细胞在完全陌生的细胞培养环境中进行复制时产生的损伤的累积所造成的。实际上,Hayflick Rubin都是部分正确,正如我们现在所知道的,大多数科学家使用的严格的细胞培养环境常常导致细胞过早衰老,而这并不总是能够反映实际的分子水平的计数机制。

 

分子生物学的起源和端粒序列的确定

 

随着DNA结构的阐明,互补碱基的双链螺旋结构的概念使科学家们开始了解遗传物质是如何在有机体和细胞系中被复制和跨代传递的。DNA复制的生物化学研究显示,当DNA复制到线性染色体末端时,DNA复制的酶反应机制遇到了一个独特的问题。这种DNA复制机制需要一个带有自由3 ' -羟基的多核苷酸引物来引发子链的合成。从理论上说,这一机制排除了由滞后链机制来合成线性DNA末端的全复制。这一理论使得James Watson1972年提出了“末端复制问题”的研究计划。

 

 

线性DNA的不完全复制被认为可导致染色体末端遗传信息的丢失。解决末端复制问题成为该领域的核心问题,而这最终将端粒长度动态学与细胞衰老、年龄老化和癌症生物学的联系起来。

 

为了解决末端复制问题所带来的挑战,有必要更好地了解端粒的分子细节。第一个端粒结构的测定是来自有纤毛的嗜热原生动物四膜虫。然后发现了酵母端粒的变异性,更多关于嗜热四膜虫染色体末端的细节显示,端粒由一个富含GC的六核苷酸序列的20-70个串联重复序列组成。在接下来的几年里,从各种真核生物中的端粒的序列和结构已被发现,它们都具有与嗜热四膜虫相似但不完全相同的特征。人类端粒中5 ' - ttaggg3 '串联重复序列于1988年确定,在包括所有哺乳动物在内的90多种真核生物中也发现了这一序列。

 

端粒序列的保守结构表明端粒具有跨物种的保守功能。端粒DNA似乎受到核酸酶降解的保护,而这表明,一组独特的蛋白质可能参与了端粒DNA的包装或结合。一种双亚单元端粒结合蛋白,最初由David Prescott的团队发现,据报道,在纤毛虫中(ciliate Oxytricha nova)可识别并紧密结合于端粒富含3G的单链突出部分。这种蛋白质,端粒末端结合蛋白(TEBP),已经被发现与芽殖酵母和分裂酵母,以及人类(端粒保护1(POT1))中有相似之处。第一个发现与双端粒DNA结合的蛋白是酿酒酵母,芽殖酵母中的抑制/激活蛋白1 (Rap1)Rap1最初被认为是一种转录调控因子,它在体内与端粒的联系提供了证据,这表明参与其他细胞功能的蛋白质也可以在端粒结构和功能中发挥不可或缺的作用。有趣的是,在与端粒结合的Rap1被发现是端粒长度的负调控因子。至少在酵母中,与端粒双体DNA结合的Rap1分子的数量似乎是作为调控端粒长度的计数机制。

 

一系列哺乳动物的DNA结合蛋白质和相关蛋白质,后来被称为shelterin 蛋白是在关于端粒结合蛋白在模式生物发现之后才被人所发现。POT1(一种端粒单链结合蛋白)和端粒重复结合因子1,以及端粒重复结合因子2(两者都与双端粒序列结合)能与另外三种蛋白协同工作,与trf1相互作用的核因子2TIN2,又称TINF2)肾上腺皮质发育不良蛋白同源物(ACD,也称为TPP1, PIP1 and PTOP)和RAP1,形成了六蛋白shelterin蛋白复合物这对端粒的正常功能以及保护哺乳动物染色体的末端起着重要作用。 TRF1TRF2都与典型的TTAGGG双链端粒重复序列结合,并与TIN2相互作用。TRF2还与双链端粒重复序列结合并与RAP1相互作用。POT1与单链TTAGGG重复序列结合,并通过结合伴侣ACD79, TRF1TRF2相互作用。最后,单链端粒突出环回折并侵入双链端粒重复序列,从而形成t-环,因此不会有暴露的游离端可能触发DNA损伤反应。这进一步帮助保持基因组完整性并提供末端保护。

 

端粒在老龄化和癌症中的作用


 

尽管Hayflick Olovnikov为复制性衰老提出了一种计数机制,但分子机制直到很久以后才被确定。1984年,Shampay等人提出假说,必定有一种酶在酵母端粒DNA中运作,类似于McClintock对无法修复末端的玉米品种的推测。这导致在1989,LundbladSzostak利用酵母遗传学的力量,展示了在芽殖酵母中,是“不断缩短的端粒”(EST)的表型导致了它们的衰老。同年,细胞表达可诱导的SV40T抗原的行为被解释为说明了人类细胞必须跳过两个独立的步骤,才能成为永生细胞。

 

 

THE END

在第二年三篇重大的论文近乎同一时间发表,这三篇文章表明以下事实:人成纤维细胞在细胞培养中的端粒在不断缩短,端粒在正常组织体内随年龄老化不断缩短一些生殖细胞组织的端粒比体细胞组织的端粒要长端粒在原发性肿瘤中非常短这些观察和其它的发现都强调了Hayflick极限理论的假设分子机制,但所有这些都是建立在相互关系的基础上的,而其直接的因果关系还有待几年后的研究才被证实。

 

 

来源:Telomeres and telomerase: three decades of progress. Nat Rev Genet. 2019 Feb 13.